豬瘟（ＣＳＦ）是一種急性熱性傳染病，是zui常見的重要豬病之一。對(duì)豬瘟的成功控制主要依賴于疫苗免疫，因此，疫苗免疫效果的優(yōu)劣對(duì)豬瘟防控起了決定性作用。豬瘟抗體水平的檢測(cè)是疫苗免疫
效果評(píng)價(jià)的主要方法。本課題組建立了豬瘟抗體間接ＥＬＩＳＡ檢測(cè)方法，并將其組裝成試劑盒，對(duì)試劑盒的批間、批內(nèi)穩(wěn)定性和保存期等進(jìn)行了研究。
一、材料與方法
1)豬瘟抗體間接ＥＬＩＳＡ（簡(jiǎn)稱Ｉ－ＥＬＩＳＡ，下同）試劑盒，由上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室研制，批號(hào)為２０１5０3０５、２０１5０4０７、２０１505０９；豬瘟抗體阻斷ＥＬＩＳＡ（簡(jiǎn)稱Ｂ－ＥＬＩＳＡ，下同）試劑盒，豬瘟陽性血清１６份和陰性血清９份，豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）。
2)批內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn):隨機(jī)抽取同一批次試劑盒中的３件，按照說明書對(duì)１６份陽性血清和９份陰性血清血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，比較試劑盒的變異系數(shù)。
3)批間穩(wěn)定性試驗(yàn):從３個(gè)不同批次試劑盒中隨機(jī)抽取１件，按照說明書對(duì)上述１６份陽性血清和９份陰性血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，比較試劑盒的變異系數(shù)。
4)保存期試驗(yàn):隨機(jī)抽取１２件試劑盒置于２℃～８℃環(huán)境中，每隔１個(gè)月取出１件對(duì)經(jīng)２倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，直至第9個(gè)月。比較不同梯度血清檢測(cè)結(jié)果的變化。
5)ＦＶＮＴ 的符合率:田間采集４７４份豬血清，用豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒和ＦＶ6)對(duì)疫苗免疫豬抗體增長(zhǎng)趨勢(shì)的檢測(cè):選取７頭豬瘟抗體陰性仔豬，分為免疫組和對(duì)照組。免疫組５頭，免疫１頭份豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）；對(duì)照組２頭，接種生理鹽水。自免疫后的第１天開始，每隔３ｄ對(duì)兩組動(dòng)物進(jìn)行前腔靜脈采血，直至第２１__天。２１ｄ后定期采血，直至免疫后的第２１３天。分別用豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ 試劑盒和豬瘟抗體Ｂ－ＥＬＩＳＡ試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
二、結(jié)果
1）批內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)：同一批試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)均小于１０％，因此說明，該試劑盒具有較好的批內(nèi)穩(wěn)定性。
2）批間穩(wěn)定性結(jié)果：不同批次反應(yīng)板的變異系數(shù)zui高為１１％，仍在１５％的可接受范圍內(nèi)，說明該試劑盒具有很好的批間穩(wěn)定性。
3）保存期試驗(yàn)：隨著保存期的延長(zhǎng)，梯度稀釋的陽性血清ＩＥ值一直維持在一個(gè)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，血清效價(jià)始終為１２８倍（ＩＥ值≥１０％）。
三、討論
1.豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒的穩(wěn)定性：ＥＬＩＳＡ試劑盒的穩(wěn)定性是試劑盒質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。在進(jìn)行試劑盒生產(chǎn)時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照已經(jīng)優(yōu)化的試驗(yàn)條件進(jìn)行，保證產(chǎn)品質(zhì)量的均一性。
2.試劑盒的保存期：保存期是試劑盒質(zhì)量的另一個(gè)重要指標(biāo)。影響保存期的因素很多，酶標(biāo)板的熱穩(wěn)定性，酶標(biāo)二抗、對(duì)照血清以及稀釋液等均會(huì)對(duì)zui終的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，在進(jìn)行試劑盒研發(fā)時(shí)應(yīng)充分考慮上述因素。本試劑盒通過保存期試驗(yàn)證明，在４℃～８℃下保存9個(gè)月，不會(huì)影響試劑盒的檢測(cè)結(jié)果。為了充分保證試劑盒的有效性，將保存期縮短３個(gè)月，即確定試劑盒zui終的保存期為6個(gè)月。
3.與ＦＶＮＴ的符合率：雖然豬瘟的診斷方法很多，但是各種技術(shù)均存在不同程度的優(yōu)缺點(diǎn)，各方法之間的相關(guān)性研究較少。ＦＶＮＴ 作為檢測(cè)豬瘟病毒中和抗體的經(jīng)典方法，是貿(mào)易的豬瘟抗體檢測(cè)方法。中和作用是特異性結(jié)合，抗體附著在游離抗原表面，阻止其吸附敏感細(xì)胞上，進(jìn)而阻止穿入細(xì)胞復(fù)制。因此，中和試驗(yàn)是zui直接反應(yīng)血清抗病毒效果的方法。根據(jù)上述結(jié)果，Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒與ＦＶＮＴ的符合率可達(dá)９２％，在基層大規(guī)模普查過程中，能夠反映中和抗體水平，為免疫程序的制定和抗體水平的監(jiān)測(cè)提供可靠的數(shù)4）對(duì)免疫豬血清抗體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：通過對(duì)免疫豬抗體增長(zhǎng)趨勢(shì)的檢測(cè)結(jié)果看出，豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ對(duì)抗體由陰轉(zhuǎn)陽的檢出時(shí)間為免疫后的１２～１５ｄ，而Ｂ－ＥＬＩＳＡ試劑盒檢測(cè)表明在免疫后的１５～２８ｄ陸續(xù)由陰性轉(zhuǎn)為陽性。由于Ｉ－ＥＬＩＳＡ 檢測(cè)的是針對(duì)Ｅ２蛋白的所有抗體，而Ｂ－ＥＬＩＳＡ檢測(cè)的是針對(duì)Ｅ２蛋白某一個(gè)表位的抗體，在免疫初期由于抗體豐度的不同，導(dǎo)致Ｉ－ＥＬＩＳＡ對(duì)陽性抗體的檢出要早于Ｂ－ＥＬＩＳＡ。另外，從兩種試劑盒檢測(cè)抗體增長(zhǎng)趨勢(shì)圖中可以看出，豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒可以對(duì)不同抗體水平的豬血清進(jìn)行有效的區(qū)分，可以從ＩＥ值上直觀的比較兩份血清抗體水平的高低。該試劑盒中所采用的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清為反復(fù)免疫的豬瘟抗體強(qiáng)陽性血清，而待檢的免疫血清在免疫后２１３ｄ達(dá)到zui高值時(shí)，仍不到陽性對(duì)照血清ＯＤ值的８０％。因此說明，Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒能夠在更寬的范圍內(nèi)對(duì)抗體水平進(jìn)行區(qū)分。而Ｂ－ＥＬＩＳＡ試劑盒采用的是阻斷ＥＬＩＳＡ原理，當(dāng)抗體達(dá)到可以將包被的抗原全部封閉的水平后，就出現(xiàn)了檢測(cè)平臺(tái)期。因此，阻斷ＥＬＩＳＡ只能在一定范圍內(nèi)對(duì)抗體水平的高低進(jìn)行區(qū)分。因此，可根據(jù)種群和生產(chǎn)需要等情況選擇不同的檢測(cè)方法。